液体培養とリアルタイムPCRを組み合わせたヨーネ菌培養検査法

タイトル	液体培養とリアルタイムPCRを組み合わせたヨーネ菌培養検査法
担当機関	（独）農業・食品産業技術総合研究機構 動物衛生研究所
研究課題名
研究期間	2006～2008
研究担当者	森　康行 永田礼子 吉原一浩
発行年度	2008
要約	液体培地を用いてヨーネ菌を培養することにより、ヨーネ菌の分離率が高まり、培養液中のヨーネ菌DNA量をリアルタイムPCRで定量することにより、培養開始後2週間という短時間でヨーネ菌の増殖を検出することが可能である。
キーワード	ヨーネ病、ヨーネ菌、液体培地、リアルタイムPCR、培養検査
背景・ねらい	ヨーネ病は我が国で最も多発している牛の法定伝染病の一つであり、診断・淘汰により防疫が進められているが、発生数の減少をみるには至っていない。ヨーネ菌の培養検査はヨーネ病の重要な診断法であるが、固形培地上ではヨーネ菌の発育が極めて遅い為、結果を得るまでに2～5ヶ月を必要とする。そこで、米国民間メーカーが開発したヨーネ菌用液体培地を利用したヨーネ菌培養とリアルタイムPCRによるヨーネ菌DNA定量法を組み合わせ、迅速なヨーネ菌培養検査法（液体培養・リアルタイムPCR検査法）の確立を目指す。
成果の内容・特徴	液体培地中のヨーネ菌は速やかに増殖し、そのDNA量は培養2週間後には培養開始時点と比較して、10～100倍に達する（図1）。 培養用糞便サンプルの前処理法として、メーカーの推奨法、従来のヘキサデシルピリジニウムクロライド（HPC）処理後にバンコマイシン、ナリジクス酸、アンホテリシンＢの混合液（VNA）処理を行う二重抗菌剤処理法（HPC-24h+VNA）（Stabel, J. Vet. Diagn. Invest. 9:375-380, 1997）、およびHPC処理を4時間とした短時間処理法（HPC-4h+VNA）を比較したところ、3者の処理方法の違いによるヨーネ菌増殖への影響は認められず（図1）、HPC短時間処理法が簡便な処理方法として推奨される。 液体培養・リアルタイムPCR検査法は初代培養検査において、寒天培養法より高い検出率を示す（表1）。
成果の活用面・留意点	寒天培地を用いるヨーネ菌分離培養法に比べ、検出感度が高くかつ検査期間の短縮が可能な液体培養・リアルタイムPCR検査法は、実用的なヨーネ菌培養検査法として野外への普及が期待される。 液体培養・リアルタイムPCR検査法は、ヨーネ菌培養成績と糞便中等のヨーネ菌DNAを直接検出する遺伝子検査成績を比較する上でも有用である。 液体培地からのヨーネ菌DNAの抽出・精製が煩雑であるため、簡便かつ効率的なDNA抽出方法の開発が重要である。
URL	http://agriknowledge.affrc.go.jp/RN/3010016334
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