液体培養とリアルタイムPCRを組み合わせたヨーネ菌培養検査法

タイトル 液体培養とリアルタイムPCRを組み合わせたヨーネ菌培養検査法
担当機関 (独)農業・食品産業技術総合研究機構 動物衛生研究所
研究課題名
研究期間 2006~2008
研究担当者 森 康行
永田礼子
吉原一浩
発行年度 2008
要約  液体培地を用いてヨーネ菌を培養することにより、ヨーネ菌の分離率が高まり、培養液中のヨーネ菌DNA量をリアルタイムPCRで定量することにより、培養開始後2週間という短時間でヨーネ菌の増殖を検出することが可能である。
キーワード ヨーネ病、ヨーネ菌、液体培地、リアルタイムPCR、培養検査
背景・ねらい  ヨーネ病は我が国で最も多発している牛の法定伝染病の一つであり、診断・淘汰により防疫が進められているが、発生数の減少をみるには至っていない。ヨーネ菌の培養検査はヨーネ病の重要な診断法であるが、固形培地上ではヨーネ菌の発育が極めて遅い為、結果を得るまでに2~5ヶ月を必要とする。そこで、米国民間メーカーが開発したヨーネ菌用液体培地を利用したヨーネ菌培養とリアルタイムPCRによるヨーネ菌DNA定量法を組み合わせ、迅速なヨーネ菌培養検査法(液体培養・リアルタイムPCR検査法)の確立を目指す。
成果の内容・特徴
  1. 液体培地中のヨーネ菌は速やかに増殖し、そのDNA量は培養2週間後には培養開始時点と比較して、10~100倍に達する(図1)。
  2. 培養用糞便サンプルの前処理法として、メーカーの推奨法、従来のヘキサデシルピリジニウムクロライド(HPC)処理後にバンコマイシン、ナリジクス酸、アンホテリシンBの混合液(VNA)処理を行う二重抗菌剤処理法(HPC-24h+VNA)(Stabel, J. Vet. Diagn. Invest. 9:375-380, 1997)、およびHPC処理を4時間とした短時間処理法(HPC-4h+VNA)を比較したところ、3者の処理方法の違いによるヨーネ菌増殖への影響は認められず(図1)、HPC短時間処理法が簡便な処理方法として推奨される。
  3. 液体培養・リアルタイムPCR検査法は初代培養検査において、寒天培養法より高い検出率を示す(表1)。
成果の活用面・留意点
  1. 寒天培地を用いるヨーネ菌分離培養法に比べ、検出感度が高くかつ検査期間の短縮が可能な液体培養・リアルタイムPCR検査法は、実用的なヨーネ菌培養検査法として野外への普及が期待される。
  2. 液体培養・リアルタイムPCR検査法は、ヨーネ菌培養成績と糞便中等のヨーネ菌DNAを直接検出する遺伝子検査成績を比較する上でも有用である。
  3. 液体培地からのヨーネ菌DNAの抽出・精製が煩雑であるため、簡便かつ効率的なDNA抽出方法の開発が重要である。
URL http://agriknowledge.affrc.go.jp/RN/3010016334
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