豚胸膜肺炎菌のPCR-RFLP法による検出及び型別

タイトル 豚胸膜肺炎菌のPCR-RFLP法による検出及び型別
担当機関 家畜衛生試験場
研究課題名
研究期間 1996～1997
研究担当者
発行年度 1997
要約 　 豚胸膜肺炎菌を高感度で検出し，１２血清型を５つのグループに型別するPCR-RFLP法を確立した。
要約(英語) To establish a method for specific detection and typing of A. pleuropneumoniae, we investigated the feasibility of PCR and restriction fragment length polymorphism (RFLP). Primers for PCR were selected from a conserved region of the outer membrane lipoprotein gene (omlA) of A. pleuropneumoniae serotypes 1 and 5a. A DNA fragment of 970 bp was amplified from the genomic DNA of all 12 serotypes of A. pleuropneumoniae. The amplification was specific to the A. pleuropneumoniae DNA but not to those of other bacteria tested, some of them are found as normal flora in upper respiratory tract of swine. The amplified DNA from all 12 serotypes specifically hybridized to the cloned omlA５ａ gene of A. pleuropneumoniae. This PCR system could detect as little as 20 pg of purified chromosomal DNA. Furthermore, digestion of the amplified DNA with the enzyme VspI yielded serotype specific polymorphic patterns, allowing discrimination of all serotypes into five distinct groups. (Lab. of Molecular Bacteriology, Department of Bacteriology and Parasitology, TEL +81-***********)
背景・ねらい 　 豚胸膜肺炎は，わが国で最も発生の多い豚の感染症の一つである。原因菌のActinobacillus pleuropneumoniae（App）は，莢膜多糖体抗原により１２血清型に分類されており，血清型別は治療や疾病防除対策及び疫学的解析の上で必須となっている。そこで，本菌の感染防御抗原の一つである外膜リポ蛋白の構造遺伝子omlAを利用し，PCR-Restriction Enzyme Length Polymorphism（RFLP）法によるAppの迅速な検出及び型別，さらに血清型との比較を試みた。
成果の内容・特徴

  1. 血清型５型と１型のomlA遺伝子の共通配列を利用し，表の条件でPCRを行った。その結果，１２血清型全ての参照株から約９７０bpの断片が増幅された（図A）。 本断片はAppとの鑑別が重要なPasteurella multocida及びMycoplasma hyopneumoniaeを含む２２菌種からは増幅されず，Appに特異的であった。
  2. 増幅断片は，制限酵素Vsp Iによって１２血清を菌が５つのグループに区分できた（図B)。また，Vsp Iの反応用とPCR用バッファーの組成が類似しているため，増幅断片をそのまま制限酵素で切断可能で，作業の迅速化を図ることができた。
  3. 以上の成績は，供試した野外分離株２０９株でも確認できた。
  4. PCRによる検出限界は，血清型５型参照株DNAを使用した場合20pgであり，これは１０３～１０４個の菌に相当した。
成果の活用面・留意点
    　 今回確立したPCR-RFLP法は特異性が高く，わが国で分離頻度が高い１，２，５及び７型をそれぞれ別のグループに区分できることから，菌の検出及び最終的な血清型別の前のスクリーニング法として有用であることが示唆された。
URL http://agriknowledge.affrc.go.jp/RN/3010016065
カテゴリ ICT 豚 防除

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