DMI剤耐性キュウリうどんこ病菌の遺伝子診断法

タイトル DMI剤耐性キュウリうどんこ病菌の遺伝子診断法
担当機関 神奈川農技セ
研究課題名
研究期間 2004~2007
研究担当者 久保深雪
植草秀敏
折原紀子
武田敏幸(全農)
北宜裕
野村研
発行年度 2007
要約 DMI剤耐性キュウリうどんこ病菌のCYP51遺伝子(ステロール脱メチル化酵素遺伝子)には特異的な塩基置換変異があり、この変異を利用して設計したプライマーを用いれば、高度耐性菌をPCR法により検出できる。
キーワード キュウリうどんこ病、DMI剤耐性菌、遺伝子診断法、CYP51遺伝子
背景・ねらい 近年、キュウリ栽培においてDMI薬剤耐性のうどんこ病菌が出現し、防除効果が低下している。有効な防除を行うため、耐性菌発生状況を把握する必要があるが、絶対寄生菌であるため、薬剤耐性試験は繁雑で時間を要する。そこで、DMI剤の標的酵素であるCYP51遺伝子の薬剤耐性程度による塩基配列の違いを基にPCR法によるDMI剤耐性菌の簡易診断技術を開発する。

成果の内容・特徴 1.
DMI剤耐性菌のうち、高度耐性菌にはCYP51遺伝子に4箇所の塩基変異が存在する(表1)。
2.
防除の実用場面で問題となるのは、生物検定においてトリフルミゾールに対するRf値が500以上となる4塩基置換変異菌である(表1、2)。
3.
4箇所の塩基変異を基に設計したプライマーセット(耐性菌検出用のR1F:AAGTTCTTCGCCTCCACTGCとR2R:CAGCGATGTCTCCCTGCGATAのセット、感受性菌検出用のS2F:TCTTCGCCTCCACGGCCCAATとS2R:CAGCGATGTCTCCCTGCGTCAのセット、増幅産物は350bp)を用れば、高度耐性菌とそれ以外の菌をそれぞれ特異的に検出できる。
4.
単一病斑を含む直径5mmのリーフディスクからCTAB法により抽出した全DNAを用いて検定ができる(表3)。

成果の活用面・留意点 1.
PCRの条件は、プライマーR1F-R2Rのセットでは、熱変性95℃4分、熱変性95℃30秒→アニーリング65℃30秒→伸長72℃30秒を35サイクル。プライマーS2F-S2Rのセットでは、熱変性95℃4分、熱変性95℃30秒→アニーリング67℃30秒→伸長72℃30秒を35サイクル、とする。
2.
本法は4箇所の塩基置換変異菌のみ検出可能であり、感受性型と1箇所の塩基置換変異型の菌は区別できない。
3.
同じ圃場で4塩基置換変異菌と1塩基置換変異菌が混在して存在するので、複数の検体を用いて圃場の耐性菌発生状況を検定する(表3)。
4.
CYP51遺伝子に塩基置換変異のない耐性菌(上流域に挿入配列がある等)は低率で存在するが、いずれもトリフルミゾールに対するRf値は500より低い。

URL http://agriknowledge.affrc.go.jp/RN/3010009013
カテゴリ うどんこ病 簡易診断 きゅうり 耐性菌 防除 薬剤耐性

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