集合法を用いた牛体細胞クローン胚の作出法

タイトル 集合法を用いた牛体細胞クローン胚の作出法
担当機関 神奈川畜研
研究課題名
研究期間 2000~2002
研究担当者 岸井誠男
橋村慎二
仲沢慶紀
田中嘉州
発行年度 2002
要約 体細胞をドナー細胞として生産した核移植胚を、集合キメラ法により複数個集合し発生させることにより、1胚あたりの細胞数が増加し、形態的に良質な胚を作成することが可能となる。また、集合を行った胚(核移植集合胚)は高い受胎率を示し、クローンとして産子を得ることができる。
キーワード 牛、体細胞クローン、核移植、細胞集合、キメラ、核移植集合胚
背景・ねらい 現在、核移植胚からのクローン産子作出効率は極めて低い。その要因の1つとして、受胎率が低く流産の発生率が高いことがあげられる。特に受胎率が低い原因として、生体由来胚に比較し核移植胚は、細胞数が少ない点が考えられる。そこで、核移植胚に細胞集合(集合キメラ)法を応用することで細胞数を増加させ、受胎率の改善を試み、クローン産子を得ることが可能であるか検討を行った。
成果の内容・特徴 1.
牛卵管由来細胞をドナー細胞として核移植を行い、融合後約80時間後に8細胞期以上に分割した胚を選択し、透明帯を除去することで割球を裸化した。複数個の胚の割球を、細く引いたパスツールピペットで、同時に軽くピペッティングすることにより密着させ、培養皿の底面に針で窪みをつけた中に入れ( needle depression・細胞集合法)、透明帯を除去したまま培養を行い、1つの胚として発生させた(図1)。
2.
通常の核移植胚および集合核移植胚を体外で7日目まで培養したところ、通常の核移植胚で64.2%(43/67)の発生率(胚盤胞数/分割胚数)に対し、3個集合を行った核移植集合胚は100%(32/32)の発生率であった。
3.
3個集合を行った核移植集合胚は、生体由来胚と比較しほぼ同等(166.3:179.9)の細胞数の構成であった(表1)。核移植集合胚の特徴として、図2に示すとおり、通常の核移植胚に比較し、明瞭な内部細胞塊を有していた。
4.
受胚牛に胚移植をおこなった結果、集合を行わない核移植胚では受胎例は得られなかったが、核移植集合胚では5頭中4頭受胎し、高い受胎率を示した(表2)。
5.
受胎例において2頭が流産し、残りの2頭が分娩した。ドナー及び産子間での遺伝的同一性が確認され、クローンとして生産されたことが実証された。
成果の活用面・留意点 1.
3個の核移植胚の割球を集合することで、生体由来胚と同程度の細胞数を持つ核移植胚を作成することができる。
2.
本手法は、受精卵クローンにも利用できる。
3.
通常の核移植胚に比較し、受胎率の改善が期待できるため、核移植胚の妊娠、胎子発育、分娩等の試験研究に応用できる。
4.
流産率、正常産子生産率の改善について検討する必要がある。
URL http://agriknowledge.affrc.go.jp/RN/3010007447
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