コムギのAFLP マーカーを効率的にSTS 化するためのExtension-AFLP 法

タイトル コムギのAFLP マーカーを効率的にSTS 化するためのExtension-AFLP 法
担当機関 (独)国際農林水産業研究センター
研究課題名
研究期間 2001~2005
研究担当者 許東河
坂智広
発行年度 2003
要約 の選抜プライマーに塩基を付加した4 種の3 次選抜プライマーを用いてnestedPCR を行うExtension-AFLP 法AFLP
背景・ねらい AFLP(増幅断片長多型)マーカーをSTS(Sequence Tagged Site)化してゲノムDNA からその特定配列をPCR
で増幅できるSTS マーカーに移行するには、AFLPターゲットバンドをサブクローニングして塩基配列を特定しPCR プライマーをデザインする。ゲノムサイズの大きいコムギでは、AFLP
のターゲットバンドに複数のゲノム領域のコピーが含まれるため、複数シークエンスからターゲット領域の配列を選び出すのが困難である。またSTS
化の過程でデザインしたプライマーを用いても、ターゲットの断片長多型を消失してしまうなどSTS 化が非常に困難である。そのため、コムギのAFLP
マーカーを効率的にSTS 化するExtension-AFLP 法を開発した。
成果の内容・特徴
  1. Extension-AFLP 法は、AFLP マーカーの選抜プライマー(selective primer)にA,T,G,C
    の塩基をそれぞれ付加した4 種の3 次選抜プライマーを用いてnested PCR を行う。その中から多型を示すターゲットDNA
    断片を増幅する選抜性の高いプライマーを選び、この操作を繰り返すことでゲノムからターゲット領域の配列を効率的に選抜する方法である。
  2. AFLP マーカーをサブクローニングする際のターゲットクローンの割合(E-ACT/M-CGAC118-120 が15.6%、E-AAC/M-CGAC285
    は37.5%)が、3 回のExtension-AFLP 操作により単一のターゲット領域の配列を選択的に選び出すことが可能で(93.8%及び87.5%)、後は従来通りシークエンスおよびPCR
    プライマーデザインすることで、従来法よりも効率的にSTS マーカーを開発できる(図1 )
  3. Extension-AFLP 法により、コムギの赤かび病抵抗性QTL に大きく寄与する3 BS 染色体の2 つのAFLPマーカーがSTS
    化(STS-118-120、STS285)でき、ターゲット領域の配列の増幅と多型が検出できる(図2,3)
  4. AFLP マーカーが優性マーカーの場合PCR失敗によるバンドの欠失の見分けが困難であるが、同時に第3のプライマーを用いて共通の増幅断片を得ることで優性マーカーでも分離が確認できる(図3)
成果の活用面・留意点
  1. Extension-AFLP による効率的なSTS 化法は、コムギ以外の場合にも適用できる。
  2. 2. AFLP際の制限酵素認識サイトに欠失がある場合は、Extension-AFLP 法でもSTS 化が困難な場合がある。
URL http://agriknowledge.affrc.go.jp/RN/3010004856
カテゴリ 抵抗性

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