チューリップに発生する2種類のポティウィルスのRT−PCR法による同時検出技術

タイトル チューリップに発生する2種類のポティウィルスのRT−PCR法による同時検出技術
担当機関 富山県農業技術センタ-
研究課題名
研究期間 1998~1998
研究担当者
発行年度 1998
要約 RT-PCR法を利用して、設計したプライマーによってチューリップがTBV(チューリップモザイクウイルス)とTBVユリ系のどちらかに感染しているかを診断できる。本プライマーを用いるとTBVとTBVユリ系を同時検出することができ、本法でユリからも検出可能である。
背景・ねらい 従来、チューリップからのウイルス検出は抗血清を用いるELISA法などによることが多かったが、これには抗血清精製の作業を必要とし、非特異反応が起こることも多い。また、2種類のウイルスを検出するには2種類の抗血清が必要である。そこで、簡便かつ高感度で非特異反応の少ないチューリップモザイク病の診断法としてPCR法を利用した同時検出法を開発する。
成果の内容・特徴
  1. 逆転写反応 ウイルス粗汁液
    (RT)反応用バッファー 30℃・30分間→42℃・15分間→
    dNTP(5μmol)95℃・5分→4℃・5分間の順で行う。
    逆転写用プライマー(50pg)
    逆転写酵素(100U)
    PCRの条件上記反応液 95℃・1分
    上流用プライマー(50pg)  55℃・2分33回繰り返す
    Taqポリメラーゼ(1U) 72℃・2分
    プライマーは逆転写・リバースプライマーとしてN819b 、フォーワードプライマーとして B1、N310fの3種類(図1)で、B1-N819b組み合わせによりTBVユリ系が約370bpの大きさのバンドとして検出され、N310f-N819bの組み合わせによりTBVが約500bpバンドとして検出される(図2レーン13、14)。また、上流用プライマーB1とN310fを同時に加え、PCRを行うことにより、TBVとTBVユリ系の同時検出が可能である(図2レーン3)。
  2. チューリップの葉、球根、花弁の粗汁液(葉と等量の0.1Mトリス-チオグリコール酸(pH9.0)で抽出)から検出可能で、ウイルス純化・除タンパクなどの前処理を必要とせず作業が簡便である。
  3. このRT-PCR法を用い自然発病株55株からの検出診断を行った結果、混合感染株が3株、TBVユリ系のみに感染している株は1株あった(図2)。
  4. 本法はユリからもウイルス検出が可能である(図3)。
成果の活用面・留意点
  1. 本検出法は高感度なので、弱毒ウイルスの選抜、増殖に使用するウイルスフリー株の検定と弱毒ウイルス感染の有無、またウイルスの増殖程度を生育の初期段階(ウイルスの増殖量が少ない段階)で検出できる。
  2. 東北農業試験場と共同で特許出願中。出願番号は平成10年特許願第289687号
URL http://agriknowledge.affrc.go.jp/RN/3010004551
カテゴリ チューリップ ゆり

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